Argonaute loading in RNAi and the miRNA pathway in C. elegans
Argonaute loading in RNAi and the miRNA pathway in C. elegans
Samenvatting
In Caenorhabditis elegans zijn RNA interferentie en de microRNA cascade gerelateerd, maar functioneel anders. Zo zijn de Argonaute eiwitten en de mechanismen van gen silencing verschillend. ALG-1 en ALG-2 zijn Argonautes die voornamelijk functioneren in de microRNA cascade terwijl RDE-1 de Argonaute is die vereist is voor RNA interferentie. In beide cascades is een klieving van een voorloper door DCR-1 nodig voor de biogenese van dubbel strengs RNA van 20-23 nucleotiden. De kleine RNA duplexen, die door Dicer geprocessed zijn lijken in beide cascades gelijk, maar worden in andere Argonautes geladen en medieëren gen silencing via verschillende mechanismen. Het enige duidelijke verschil in de structuur van de micro- en small interfering RNA duplexen is de hoeveelheid complemen-tariteit in de duplexen: microRNA duplexen bevatten altijd meerdere mismatchen, terwijl de small interfering RNA duplexen perfect complementair zijn. Wij stellen als hypothese dat dit verschil in complementariteit de oorzaak is dat de verschillende duplexen aan verschillende Argonautes binden. Om deze hypothese te testen hebben we verschillende versies gemaakt van een small interfering RNA die tot expressie komt in een microRNA voorloper. Deze small interfering RNA (22siRNA) leidt tot de silencing van het unc-22 gen. In tegenstelling tot de 22siRNA die volledig complementair is, hebben deze aangepaste versies mismatchen in de RNA duplex en/of tussen de guide strand en het messenger RNA van het unc-22 gen. Om het laden van Argonautes in vivo te analyseren, is de formatie van de RNA-Argonaute complexen bestudeerd met Fast Protein Liquid Chromatography. We ontdekten dat duplexen die volledig complementair zijn in dezelfde fracties aanwezig zijn als RDE-1. Dit in tegenstelling tot duplexen met een 3-nucleotide uitstulping in dezelfde fracties aanwezig zijn als ALG-1. Ten tweede hebben we ook de aan- of afwezigheid van het unc-22 fenotype geanalyseerd. We ontdekten dat het fenotype niet geïnduceerd wordt; 1) in wormen met een rde-1 mutatie (wat bewijst dat het fenotype veroorzaakt wordt via RNA interferentie), 2) wanneer een 3-nucleotide uitstulping in de guide strand een juiste binding met het messenger RNA voorkomt en 3) wanneer een 3-nucleotide uitstulping aanwezig is aan één van de uiteinden van de passenger strand.
Organisatie | Hogeschool Utrecht |
Opleiding | Biologie en Medisch Laboratorium Onderzoek |
Afdeling | Life Sciences en Chemistry |
Partner | Hubrecht Institute |
Jaar | 2007 |
Type | Bachelor |
Taal | Nederlands |