Samenvatting

Dermatophyten veroorzaken infecties in de haren, huid en nagels. Infecties veroorzaakt door dermatophyten worden dermatomycosen genoemd. Wanneer de huid geïnfecteerd is ontstaan er rode schrale plekken (ringworm). Dermatomycosen zijn één van meest gangbare, besmettelijkste ziekten wereldwijd. Transmissie van dermatomycosen verloopt via direct contact met een geïnfecteerde gastheer of via indirect contact met geïnfecteerde haren, huid, kleren of vloeren.

Diagnostiek voor de detectie en identificatie van dermatophyten in klinisch materiaal bestaat uit directe microscopie en kweek. Deze diagnostiek wordt de conventionele diagnostiek genoemd. Conventionele diagnostiek kost veel tijd, bovendien is de sensitiviteit is laag.

In 2005 was een multiplex real-time polymerase chain reaction opgezet voor de detectie en identificatie van de meest voorkomende pathogene dermatophyten species in klinische monsters in minder dan 24 uur. Internal Transcribed Spacers 1 en 2 werden gebruikt als target. Amplificatie en detectie werden uitgevoerd op de iCycler IQ4™ real-time detection system (Biorad, Veenendaal, Nederland).

Het doel van dit project was het aanpassen en optimaliseren van de in 2005 opgezette multiplex real-time polymerase chain reaction. Hiervoor waren verschillende processen nodig. Amplificatie en detectie werden geoptimaliseerd op de Applied Biosystems 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, USA). Een species-specifieke Epidermophyton floccosum probe werd ontwikkeld en toegevoegd aan één van de multiplex reactie mixen. Ook werden de primers en probe van de interne controle toegevoegd aan één de multiplex reactie mix. Desoxyribonucleïnezuur extractie methoden werden vergeleken voor optimale opbrengst van het desoxyribonucleïnezuur extract.

Dit project werd gevalideerd met klinische materialen en gereed gemaakt voor implementatie in de routine diagnostiek. Totaal werden 53 klinische materialen (nagels, huid en haren), welke voor schimmeldiagnostiek werden ingestuurd verzameld. De materialen werden volgens de conventionele diagnostiek beoordeeld. De klinische materialen werden met verschillende voorbehandel - en desoxyribonucleïnezuur extractie methoden getest. Om te kunnen toezien op de kwaliteit van desoxyribonucleïnezuur extractie en polymerase chain reaction remming werd het niet humane virus Phocid herpesvirus 1 als interne controle gebruikt. Na desoxyribonucleïnezuur extractie volgde amplificatie en detectie welke werd uitgevoerd op de Applied Biosystems 7500 (ABI, USA).

In real-time polymerase chain reaction waren 36 monsters positief (67,9%). Met kweek waren 29 monsters positief (54,7) en met microscopie waren 31 monsters positief (58,5%). In de conventionele diagnostiek waren 7 monsters positief met microscopie, maar bleven negatief in de kweek. Met real-time PCR werden deze monsters eveneens positief bevonden.
De oorspronkelijke multiplex real-time polymerase chain reaction was aangepast en geoptimaliseerd op de ABI 7500. Dermatophyten desoxyribonucleïnezuur werd geëxtraheerd uit klinisch materiaal met een handmatige- en automatische extractie methoden.
Uit de validatie is gebleken dat de specificiteit en sensitiviteit van de real-time PCR hoger is vergeleken met de conventionele diagnostiek. Er was minder hands-on time en het was mogelijk onderscheid te maken tussen de dermatophyten (sub)species met real-time polymerase chain reaction.