De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Real Time PCR voor de directe detectie van klinisch relevante mycobacteriën

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Real Time PCR voor de directe detectie van klinisch relevante mycobacteriën

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Atypische mycobacteriën worden tegenwoordig steeds vaker geïsoleerd. Ze kunnen overal in het lichaam infecties veroorzaken zoals lymfklierinfecties, huidinfecties, infecties aan gewrichten en botten, katheter infecties enz. Mycobacteriën kunnen traditioneel gedetecteerd worden door een Ziehl-Neelse kleuring en een auramine-rhodamine kleuring. Wanneer beide kleuringen positief zijn wordt er een Real Time PCR uitgevoerd om te kunnen bevestigen dat de infectie wordt veroorzaakt door mycobacteriën. Sputum monsters uit patiënten zijn gecontamineerd met bacteriën die commensaal in de luchtwegen voor komen zoals Corynebacterium, Rhodococcus en Nocardia. Deze commensalen worden in de Real Time PCR die op het VUmc wordt uitgevoerd ook positief. Een uitslag van de Real Time PCR geeft dus geen uitsluitsel dat er mycobacteriën in het sputum monster zitten. Er moet dus een Real Time PCR ontwikkeld worden die alleen positief is voor mycobacteriën.
Het is bekend dat alle mycobacteriën die tot nu toe zijn bestudeerd minimaal drie ESX clusters hebben. In Corynebacterium en Streptomyces komt een regio voor die op het ESX cluster lijkt en dit cluster lijkt het meest op ESX-4. Waarschijnlijk komt het ESX-3 cluster in alle mycobacteriën voor. In M. tuberculosis is dit ESX-3 cluster essentieel voor de groei. Men denkt dat het ESX-5 cluster alleen in langzaam groeiende mycobacteriën voorkomt.
Het ESX-3 cluster en ESX-5 cluster zijn gebruikt om een Real Time PCR op te zetten die alleen mycobacteriën detecteert. Hiervoor is in silico een alignment gemaakt met bekende sequenties van mycobacteriën en zijn er primersets ontwikkeld. Deze primersets zijn getest door middel van een PCR. De primerset van het ESX-3 cluster detecteerde alleen M. triviale en M. avium niet. De primerset van ESX-5 was alleen positief voor de langzaam groeiende mycobacteriën. Vervolgens is er gekeken of de primersets geschikt waren voor de Real Time PCR. Voor de Real Time PCR mag het PCR product niet groter dan 200 nucleotiden zijn. Omdat het PCR product van het ESX-3 cluster groter is, zijn er twee nieuwe primersets ontwikkeld. De primersets zijn getest met een SYBR Green Real Time PCR. Hiermee kun je meteen de smelttemperatuur van het PCR product bepalen. Met de smelttemperaturen van de PCR producten kan er gekeken worden of er aspecifieke PCR producten gevormd worden. De primerset ESX-3.1 was negatief voor M. abcessus en M. chelonae en M. fortuitum, maar positief voor Corynebacterium. De primerset ESX-3.2 was negatief voor M. abcessus, maar positief voor Corynebacterium. Bij beide primersets hadden de PCR producten niet ongeveer dezelfde smelttemperatuur. Met beide primersets is er niet verder gegaan. De smelttemperaturen van de PCR producten van de primerset ESX-5 waren ongeveer allemaal gelijk. Voor deze primerset is een probe ontwikkeld. Hiervoor is er is geprobeerd te sequencen. Dit is gelukt voor M. haemophilum en M. ulcerans. Verder is er een in silico alignment gemaakt van het ESX-5 PCR product. Hiervoor zijn bekende sequenties gebruikt en de ESX-5 PCR product sequenties van M. haemophilum en M. ulcerans. De Real Time PCR met een specifieke MGB probe detecteert: M. abcessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. phlei, M. triviale, M. malmoense, M. scrofulaceum, M. bovis BCG, M. tuberculosis, M. marinum, M. ulcerans, M. leprae, M. avium, M. kansasii en M. intracellulare.
Nadat de ESX-5 Real Time PCR goed verliep is deze vergeleken met een Real Time PCR uit de literatuur die de ITS (Internal Transcribed Spacer region) als target heeft. Deze ITS Real Time PCR detecteerde naast de mycobacteriën die de ESX-5 Real Time PCR detecteert: M. holsaticum, M. interjectum, M. xenopi, M. gordonae en M. szulgai. De ITS Real Time PCR detecteert wel alle geteste mycobacteriën en de ESX-5 Real Time PCR niet. Het ESX-3 cluster en het ESX-5 cluster bleken uiteindelijk niet geschikt om een Real Time PCR op te zetten die alle mycobacteriën detecteert. De ITS Real Time PCR moet geoptimaliseerd worden zodat deze Real Time PCR gebruikt kan worden voor de diagnostiek van mycobacteriën.

Toon meer
OrganisatieHogeschool Utrecht
OpleidingBiologie en Medisch Laboratorium Onderzoek
AfdelingLife Sciences en Chemistry
PartnerVrije Universiteit Amsterdam, Medische Centrum, Afdeling: Medische Microbiologie en Infectiepreventie
Jaar2007
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk