De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Developing a genotyping assay for HCV resistance for new direct acting antivirals

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Developing a genotyping assay for HCV resistance for new direct acting antivirals

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Hepatitis C is a liver disease caused by hepatitis C virus that affects millions of people worldwide. This year, new medicines (direct acting-antivirals) have been approved. Until now, no HCV resistance analysis assay was available. Therefore, the primary objective of this project was to develop a genotyping assay for HCV resistance for new direct acting antivirals for the NS3, NS5a and NS5b gene regions and to determine the lower limit of detection of the assay. This project had several side questions: one of the side questions of this project was if there was any difference in sequence quality if samples were isolated with QiaSymphony or MagNA Pure LC. Another one of the side questions of this project was whether it mattered for quality of sequencing results if samples were diluted with RPMI-culture medium or negative human plasma. For the last side question the effectiveness of cDNA synthesis was compared with random hexamer primers or specific forward or reverse primers.
The primers for the project were developed according to gene region and genotype. The genotypes tested were genotype 1a, 1b, 2, 3a and 4, as they are the most commonly occurring genotypes. RNA from patient plasma samples was isolated with the QiaSymphony and/ or MagNA Pure LC. cDNA was synthesized from the isolated RNA and an outer PCR and nested PCR were performed. The PCR results were analyzed on a agarose gel and positive samples were analyzed by Sanger sequencing. For analyzing the results, software tools were utilized for the clinical interpretation of found drug resistance associated mutations (DRMs).
The assay was successfully developed and can be used for diagnostic purposes. The lower limit of detection was determined for all genotypes and gene regions, only the NS5a and NS5b gene regions of genotype 2 did not meet the criteria for a solid assay. The side questions were also answered, it can be concluded that the QiaSymphony and MagNA Pure LC isolation methods can be used interchangeably. Comparison of dilution of samples with RPMI-culture medium or negative human plasma showed no significant difference. However it was discovered that using random hexamer primers for cDNA synthesis gives better results than using specific primers.
3
Samenvatting
Hepatitis C is een ontsteking van de lever die door het hepatitis C virus is veroorzaakt en treft miljoenen mensen wereldwijd. Dit jaar zijn er nieuwe medicijnen (direct-acting antivirals) goedgekeurd. Voor deze direct-acting antivirals is het nodig om een genotypisch assay voor HCV resistentie op te zetten. Om deze reden was het hoofddoel van dit onderzoek het ontwikkelen van een genotypisch assay voor HCV resistentie voor nieuwe direct acting antivirals, voor de NS3, NS5a en NS5b gen regio’s en het bepalen van het laagste detectie limiet van de assay. Er waren ook enkele andere onderzoeksvragen; maakt het uit voor het sequensen of samples met de QiaSymphony of MagNA Pure LC werden geïsoleerd. Een andere onderzoeksvraag was of de sequenties beter waren als de samples met RPMI medium of negatief humaan plasma werden verdund. De laatste onderzoeksvraag was of het uitmaakte voor sequensen of cDNA synthese met random hexameer of specifieke forward of reverse primers werd uitgevoerd.
De gebruikte primers zijn ontwikkeld afhankelijk van genotype en gen regio. De genotypen 1a, 1b, 2, 3a en 4 zijn getest, aangezien dat de meest voorkomende genotypen zijn. RNA van patiënt plasma samples zijn geïsoleerd met de QiaSymphony en/of MagNA Pure LC. cDNA werd gesynthetiseerd uit het geïsoleerde RNA en een conventionele en nested PCR zijn daarop uitgevoerd. Deze PCR resultaten zijn geanalyseerd op een agarose gel en de positieve samples zijn doormiddel van sequensen geïsoleerd. Het analyseren van de resultaten voor klinische interpretatie is uitgevoerd met verschillende software voor het vinden van resistentie geassocieerde mutaties.
De assay is succesvol ontwikkeld en kan in de diagnostiek gebruikt worden. Het laagste detectie limiet van de assay is bepaald voor alle genotypen en gen regio’s, alleen de NS5a en NS5b gen regio’s van genotype 2 voldoen niet aan de criteria voor een goed assay. Alle overige onderzoeksvragen zijn ook beantwoord, er kan geconcludeerd worden dat de QiaSymphony en MagNA Pure LC isolatie methoden beide gebruikt kunnen worden. Het vergelijken van verdunningen van samples met RPMI medium of negatief humaan plasma maakte geen significant verschil voor de sequentie uitslagen. Er is echter wel ontdekt dat het gebruik van random hexameer primers leidt tot beter sequenties dan het gebruik van specifieke primers.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersErasmus MC
Jaar2016
TypeBachelor
TaalEngels

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk