De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Paracetamol in neonaten

Validatie van de analyse van paracetamol en metabolieten met behulp van UPLC-MS/MS

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Paracetamol in neonaten

Validatie van de analyse van paracetamol en metabolieten met behulp van UPLC-MS/MS

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Dit verslag beschrijft de validatie van een methode om paracetamol (APAP) en vijf metabolieten te kunnen identificeren en kwantificeren in kleine volumina plasma van neonaten. Door de recente beschikbaarheid van paracetamol voor neonaten is er nog weinig bekend over dosering, efficiëntie en veiligheid. Uit onderzoek is gebleken dat het paracetamol metabolisme onderontwikkeld is in premature neonaten. Dit geeft een verhoogd risico op overdosering waarbij er een overmatige vorming van het hepatotoxische metaboliet NAPQI ontstaat.
Het doel van dit project was om de ontwikkelde UPLC-MS/MS methode voor de kwantificering van APAP en metabolieten verder te optimaliseren en te valideren. Met de gevalideerde methode kunnen 10 µl plasmamonsters van neonaten worden geanalyseerd waardoor bekend wordt in hoeverre paracetamol via de mogelijk hepatotoxische route wordt afgebroken. Aan de hand van deze kennis kan door artsen een veilige dosering worden bepaald. Ook kan deze methode gebruikt worden voor het in kaart brengen van het APAP metabolisme in andere speciale patiënten populaties, zoals kinderen met het syndroom van Down of anorexia patiënten.
De methode is ontwikkeld voor de analyse van APAP, APAP-sulfaat, APAP-glucuronide, APAP-glutathion, APAP-cysteïne en APAP-mercapto. Als interne standaarden zijn APAP-D4 en APAP-D3-sulfaat gebruikt. De monstervoorbewerking bestond uit eiwitprecipitatie met methanol en verdunning met 0,1% waterig mierenzuur. Er is gebruik gemaakt van een Dionex Ultimate UPLC-systeem gekoppeld aan een Thermo TSQ Vantage MS met ESI-probe en een Acquity UPLC HSS T3 kolom. De totale runtijd bedroeg 5.3 minuten. Het injectievolume voor paracetamol was 4 µL en voor de overige componenten 10 µL.
Voor de validatie van de methode zijn de volgende parameters getest: lineariteit, LLOQ, ULOQ, juistheid, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, stabiliteit, indampeffect en matrixeffect/recovery. Voor het testen van de lineariteit is er gebruik gemaakt van calibratie standaarden van 0,05 mg/L tot en met 50 mg/L. De methode heeft een lineaire calibratie curve voor elk component met r ≥ 0.9950 en r2 ≥ 0.9900 in een gepast concentratiegebied. Voor alle componenten is er een LLOQ behaald tussen de 0,01 en 0,05 mg/L. Kwaliteitscontroles (QC’s) zijn bereid op drie concentratie levels: QC Laag [0.20 mg/L], QC Midden [1.5 mg/L] en QC Hoog [15 mg/L]. De juistheid voor deze QC concentraties was voor alle componenten binnen de eis van <15%, behalve voor QC Hoog van APAP-Cysteïne. De methode heeft een goede herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid voor alle componenten. De monsters zijn 48 uur stabiel in de autosampler en blijven 24 uur stabiel wanneer deze voor de opwerking bij 6 °C worden bewaard. De korte stabiliteit is te wijten aan APAP-glut welke snel wordt gehydrolyseerd in plasma. Er is geen indampeffect geconstateerd. Tot slot is het matrixeffect en de recovery getest. Er was geen matrixeffect waargenomen voor APAP, APAP-cys en APAP-sulf. Bij APAP-gluc vond ion enhancement plaats en bij APAP-merc en APAP-glut ion suppressie. De methode had voor alle componenten een goede recovery, behalve voor APAP-glut. Dit is mogelijk te wijten aan de instabiliteit van APAP-glut.

This report describes the validation of a method to identify and quantify acetaminophen (APAP) and five acetaminophen-metabolites in small volumes of plasma from neonates. Due to the recent availability of paracetamol for neonates there is limited information about safe and efficient dosing. Research has shown that the acetaminophen metabolism is not fully developed in premature neonates. This indicates an increased risk of overdose where there is an excessive formation of the hepatotoxic metabolite NAPQI.

The aim of this project was to further optimize and validate the developed UPLC-MS/MS method for quantifying APAP and APAP-metabolites. With the validated method, 10 µL plasma samples from neonates can be analyzed to see the extent to which APAP is metabolized via the hepatotoxic route. On the basis of this knowledge, doctors can determine a safe dosage. Furthermore, this method can be used to analyze the APAP metabolism in other special patient populations, like children with Down syndrome or anorexia patients.
This method is developed to analyze APAP, APAP-sulfate, APAP-glucuronide, APAP-glutathione, APAP-cystein and APAP-mercapturate. As internal standards APAP-D4 and APAP-D3-sulfate were used. The sample preparation consisted of protein precipitation with methanol and dilution with 0,1% aqueous formic acid. There has been made use of a Dionex Ultimate UPLC-system linked to a Thermo TSQ Vantage MS with ESI-probe and an Acquity UPLC HSS T3 column. The total runtime was 5.3 minutes. The injection volume was 4 µL for APAP and 10 µL for the other components.
The following parameters were investigated for the method validation: linearity, LLOQ, ULOQ, accuracy, repeatability, reproducibility, stability, effect of the evaporation of standards/QC’s and matrix effect/recovery. For the linearity, calibration standards with a concentration of 0.05 mg/L up to and concluding 50 mg/L were used. The method has a linear calibration curve for every component with r ≥ 0.9950 and r2 ≥ 0.9900 in a relevant concentration range. For all components, a LLOQ is measured between 0,01 mg/L and 0,05 mg/L. Quality Control samples (QC’s) were made at three concentration levels: QC Low, [0.20 mg/L], QC Medium [1.5 mg/L] and QC High [15 mg/L]. The accuracy for the QC concentrations were within the requirement of <15% for all components, except for QC High for APAP-cys. The method had a good repeatability and reproducibility for all components. The samples are stable for 48 hours in the auto sampler at 15 °C and 24 hours when stored at 6 °C prior to preparation. The short stability is due to APAP-glut, which is rapidly hydrolyzed in plasma. There has been no significant difference found between standards who were evaporated under nitrogen flow and samples who were not. Finally matrix effects and recovery were tested. There was no matrix effect observed for APAP, APAP-cys and APAP-sulf. For APAP-gluc ion enhancement took place and for APAP-merc and APAP-glut ion suppression. The method had a good recovery for all components, except for APAP-glut. This is possibly due to the instability of this component.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersErasmus MC Rotterdam
Jaar2016
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk