De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

The development of monoclonal antibodies against Multiple Myeloma SET domain

Rechten: Alle rechten voorbehouden

The development of monoclonal antibodies against Multiple Myeloma SET domain

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Summary

One of the most complex systems in the human body is the immune system. Due to complex interactions between genes, proteins and cells, the body is protected against pathogens. One defect in these interactions can cause several diseases. One of the diseases that can occur by a defect on several genes is Multiple Myeloma (MM). MM is caused by non-functional plasma cells, the last stage of the B cell differentiation. Overexpression of the Multiple Myeloma SET domain (MMSET) gene, due to translocations with immunoglobulin heavy chain, causes MM and has also the worst prognosis in all cases of MM. At this moment the blood sample analysis, needed for diagnosis of MM, takes several days. However when analysis can be made done based on flow cytometry, a diagnosis can be made in several hours. Unfortunately, no suitable antibody against MMSET is available.

The aim of this project was to generate monoclonal antibodies (MoAb) suitable for flow cytometry. The MoAb should be directed against a part of the MMSET protein that is present in the different variants found in patients with MM. However the internship was too short to see all the steps of the antibody production. Therefore, part of the practical work in this project was done for MoAb against the Tal1 protein. Tal1 overexpression is one of the markers for T cell acute lymphocytic leukemia.

During the project, two different DNA constructs were generated. One construct suitable for protein over production contained the sequence of the antigenic protein fragment used for immunization. The antigenic fragment was produced and mass spectrometric analysis showed that indeed the protein fragment was purified. This protein can be used for future immunizations. The other construct contained the largest MMSET variant present in MM patients. This construct can be used to express the protein in COS cells. After immunization, these transfected COS cells will be used for antibody recognition on the native protein.

The project after immunisation was done for Tal1. After several boosts with the Tal1 antigen fragment the mice were screened for specific Tal1 antibodies. Mice plasma cells were isolated from the spleen and fused with SP2/0 Myeloma cells, to generate hybridomas. After several screenings three Tal1 antibody producing clones were selected and were tested in Western blot and flow cytometry on transfected COS cells and positive cell lines. Only positive staining was detected by transfected COS cells on Western blot. None of the antibodies worked in Flow cytometry.

Samenvatting

Eén van de meest complexe systemen in het menselijke lichaam is het immuunsysteem. Door de complexe interacties tussen genen, eiwitten en cellen is het lichaam beschermd tegen allerlei pathogenen. Naast pathogenen kunnen ziekten ook veroorzaakt worden door een defect in een van de genen. Eén van de ziektes is Multiple Myeloma (MM). MM wordt veroorzaakt door defecte plasmacellen, het laatste stadia in de B cel ontwikkeling. Bij MM wordt het Multiple Myeloma SET domain (MMSET) gen tot overexpressie gebracht door een translocatie met immunoglobulin zware keten. Patiënten met deze translocatie en daardoor overexpressie van het MMSET gen hebben de slechtste prognose voor genezing. De volledige diagnose van MM duurt een aantal dagen. Echter, wanneer een diagnose gesteld kan worden met behulp van een flow cytometrische analyse, kan de diagnose in enkele uren vastgesteld worden. Op dit moment echter zijn er geen geschikte antistoffen tegen MMSET beschikbaar, welke noodzakelijk zijn voor een diagnose met behulp van flow cytometrie.

Het doel van dit project was om MMSET specifieke antistoffen te ontwikkelen welke geschikt zijn door een flow cytometrische toepassing. Echter, de stage was te kort om alle stappen van antistof ontwikkeling te zien. Om toch met alle technieken in aanraking te komen, zijn deze uitgevoerd met het Tal1 gen, welke al eerder geintieerd was. Tal1 is een marker voor T cel acute lymfoblastische leukemie

Tijdens dit project is een MMSET antigeen fragment geproduceerd met behulp van verschillende DNA en eiwit technieken. Dit fragment zal gebruikt worden voor de immunisatie van balb/c muizen. Daarnaast is er een full length MMSET construct gemaakt voor het transfecteren van COS cellen. Deze getransfecteerde cellen zullen gebruikt worden om de antistofherkenning tegen het native eiwit te testen.

Het traject na immunisatie is gedaan voor het Tal1 eiwit. Na een aantal boosts met het Tal1 antigeen fragment werden de muizen gescreend voor productie van specifieke Tal1 antistoffen. Plasma cellen werden geïsoleerd uit de milt van de muis en gefuseerd met SP2/0 Myeloma cellen, voor het verkrijgen van hybridoma's. De hybridoma's die antistoffen produceerden tegen Tal1 werden gesubcloneerd zodat er een monoklonale cel cultuur ontstond, deze werden daarna geëxpandeerd. De antistoffen werden opgezuiverd uit het kweeksupernatant en getest op getransfecteerde COS cellen en cellijnen positief en negatief voor Tal1. De expressie van Tal 1 werd bepaald met behulp van Western blot analyse en flow cytometrie. Een positieve aankleuring werd alleen gedetecteerd bij getransfecteerde COS cellen op Western blot. Bij de flow cytometrie was geen enkele aankleuring te zien.


Summary

One of the most complex systems in the human body is the immune system. Due to complex interactions between genes, proteins and cells, the body is protected against pathogens. One defect in these interactions can cause several diseases. One of the diseases that can occur by a defect on several genes is Multiple Myeloma (MM). MM is caused by non-functional plasma cells, the last stage of the B cell differentiation. Overexpression of the Multiple Myeloma SET domain (MMSET) gene, due to translocations with immunoglobulin heavy chain, causes MM and has also the worst prognosis in all cases of MM. At this moment the blood sample analysis, needed for diagnosis of MM, takes several days. However when analysis can be made done based on flow cytometry, a diagnosis can be made in several hours. Unfortunately, no suitable antibody against MMSET is available.

The aim of this project was to generate monoclonal antibodies (MoAb) suitable for flow cytometry. The MoAb should be directed against a part of the MMSET protein that is present in the different variants found in patients with MM. However the internship was too short to see all the steps of the antibody production. Therefore, part of the practical work in this project was done for MoAb against the Tal1 protein. Tal1 overexpression is one of the markers for T cell acute lymphocytic leukemia.

During the project, two different DNA constructs were generated. One construct suitable for protein over production contained the sequence of the antigenic protein fragment used for immunization. The antigenic fragment was produced and mass spectrometric analysis showed that indeed the protein fragment was purified. This protein can be used for future immunizations. The other construct contained the largest MMSET variant present in MM patients. This construct can be used to express the protein in COS cells. After immunization, these transfected COS cells will be used for antibody recognition on the native protein.

The project after immunisation was done for Tal1. After several boosts with the Tal1 antigen fragment the mice were screened for specific Tal1 antibodies. Mice plasma cells were isolated from the spleen and fused with SP2/0 Myeloma cells, to generate hybridomas. After several screenings three Tal1 antibody producing clones were selected and were tested in Western blot and flow cytometry on transfected COS cells and positive cell lines. Only positive staining was detected by transfected COS cells on Western blot. None of the antibodies worked in Flow cytometry.

Samenvatting

Eén van de meest complexe systemen in het menselijke lichaam is het immuunsysteem. Door de complexe interacties tussen genen, eiwitten en cellen is het lichaam beschermd tegen allerlei pathogenen. Naast pathogenen kunnen ziekten ook veroorzaakt worden door een defect in een van de genen. Eén van de ziektes is Multiple Myeloma (MM). MM wordt veroorzaakt door defecte plasmacellen, het laatste stadia in de B cel ontwikkeling. Bij MM wordt het Multiple Myeloma SET domain (MMSET) gen tot overexpressie gebracht door een translocatie met immunoglobulin zware keten. Patiënten met deze translocatie en daardoor overexpressie van het MMSET gen hebben de slechtste prognose voor genezing. De volledige diagnose van MM duurt een aantal dagen. Echter, wanneer een diagnose gesteld kan worden met behulp van een flow cytometrische analyse, kan de diagnose in enkele uren vastgesteld worden. Op dit moment echter zijn er geen geschikte antistoffen tegen MMSET beschikbaar, welke noodzakelijk zijn voor een diagnose met behulp van flow cytometrie.

Het doel van dit project was om MMSET specifieke antistoffen te ontwikkelen welke geschikt zijn door een flow cytometrische toepassing. Echter, de stage was te kort om alle stappen van antistof ontwikkeling te zien. Om toch met alle technieken in aanraking te komen, zijn deze uitgevoerd met het Tal1 gen, welke al eerder geintieerd was. Tal1 is een marker voor T cel acute lymfoblastische leukemie

Tijdens dit project is een MMSET antigeen fragment geproduceerd met behulp van verschillende DNA en eiwit technieken. Dit fragment zal gebruikt worden voor de immunisatie van balb/c muizen. Daarnaast is er een full length MMSET construct gemaakt voor het transfecteren van COS cellen. Deze getransfecteerde cellen zullen gebruikt worden om de antistofherkenning tegen het native eiwit te testen.

Het traject na immunisatie is gedaan voor het Tal1 eiwit. Na een aantal boosts met het Tal1 antigeen fragment werden de muizen gescreend voor productie van specifieke Tal1 antistoffen. Plasma cellen werden geïsoleerd uit de milt van de muis en gefuseerd met SP2/0 Myeloma cellen, voor het verkrijgen van hybridoma's. De hybridoma's die antistoffen produceerden tegen Tal1 werden gesubcloneerd zodat er een monoklonale cel cultuur ontstond, deze werden daarna geëxpandeerd. De antistoffen werden opgezuiverd uit het kweeksupernatant en getest op getransfecteerde COS cellen en cellijnen positief en negatief voor Tal1. De expressie van Tal 1 werd bepaald met behulp van Western blot analyse en flow cytometrie. Een positieve aankleuring werd alleen gedetecteerd bij getransfecteerde COS cellen op Western blot. Bij de flow cytometrie was geen enkele aankleuring te zien.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersDynomics te Rotterdam
Jaar2008
TypeBachelor
TaalEngels

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk