De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Opzetten en valideren van een real-time PCR voor detectie van virulente stammen van Yersinia enterocolitica en voor Mycoplasma genitalium

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Opzetten en valideren van een real-time PCR voor detectie van virulente stammen van Yersinia enterocolitica en voor Mycoplasma genitalium

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Samenvatting

Yersinia enterocolitica is een Gramnegatieve bacterie die een infectie in het maag-darmkanaal kan geven. De bacterie werd met behulp van een kweek aangetoond waardoor pas na 3 dagen een uitslag kon worden gegeven. Vervolgens moest het monster nog worden opgestuurd naar het RIVM om de bacterie te typeren.
Met een PCR voor alleen virulente Y.enterocolitica wordt veel tijd gespaard. Daarnaast zijn er al (multiplex)-PCR assay's voor fecesscreening ontwikkeld, waar een Yersinia-PCR mogelijk bijgevoegd zou kunnen worden en er nog meer tijd kan worden bespaard. Ook voor de Mycoplasma genitalium zou een real-time PCR om deze bacterie te detecteren een oplossing zijn, omdat de bacterie zeer moeilijk te kweken is. Het doel van deze afstudeerstage is daarom een real-time PCR op zetten en te valideren voor virulente stammen van ¬Yersinia enterocolitica¬ en voor Mycoplasma genitalium.

Er was na literatuuronderzoek al bekend dat het Attachment Invasion Locus gen (Ail-gen) alleen bij virulente Yersinia-stammen voorkomt en dus geschikt is als target voor een PCR. Door middel van PCR-experimenten met verschillende primersets is gebleken dat de primers uit het artikel 'Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay' van W.J.B Wannet et .al.[12] de beste resultaten gavenf. [12] Daarna zijn er probes bij deze primersets ontwikkeld met het programma LightCycler® Probe Design. Deze primers en probes zijn weergegeven in bijlage I.
De PCR is gevalideerd op de een nieuwe LightCycler 480 II van Roche[10]. De PCR is betrouwbaar en specifiek voor alle virulente serotypen van de Y.enterocolitica. Ook was de bacterie nog aantoonbaar bij een concentratie van <1 bacteriën per monster. Dit komt overeen met de PCR beschreven in het artikel van W.J.B. Wannet et al. Omdat was besloten om de PCR bij de PCR voor remmingcontrole en Shiga toxine-2f-producerende E.coli (STEC of Stx2f) te voegen, is de gevoeligheid ook in deze multiplex-PCR getest. De PCR werd iets minder gevoelig met 4,5 bacteriën per monster. Bij een positieve Stx2f werd de PCR geremd, wat geen probleem vormde omdat beide bacteriën zelden worden gevonden en de kans dat ze beide positief zijn dus heel klein is. Vervolgens zijn de labels aan de probes voor de remmingscontrole en Y.enterocolitica verwisseld om bij de Y.enterocolitica een beter signaal te krijgen. Tot slot zijn de resultaten van een PCR van patiëntenmonsters vergeleken met de resultaten van het routine onderzoek van deze monsters.
Na alle bovengenoemde aanpassingen kwamen de resultaten overeen en voldeed de PCR aan alle eisen van een validatie. Na het schrijven inwerken van een validatierapport de analisten op de LightCycler® 480 II, zalis de PCR in de routine in gebruik worden genomen bij het routine onderzoek.

Na de opzet van een PCR voor virulente stammen van de Y.enterocolitica is begonnen met de ontwikkeling van een real-time PCR om Mycoplasma genitalium aan te tonen. Dit micro-organisme kan onder andere urethritis bij mannen en cervicitis en onvruchtbaarheid bij vrouwen veroorzaken.
Omdat de M.genitalium zeer moeilijk te kweken is, was er op het MMI in Goes nog geen test om dit micro-organisme aan te tonen. Daarom is er begonnen om een TaqMan® PCR assay te ontwikkelen voor de detectie van M.genitalium. Het gen voor het MgPa-adhesiemolecuul, waarmee de bacterie zich hecht aan epitheelcellen van de eileiders, is gebruikt als target. Het MgPb-gen is een onderdeel van het MgPa-operon, die uit drie genen bestaat.
De primers en Taqman® probe die zijn gebruikt voor het MgPa-gen komen uit het artikel 'en het artikel 'Use of a Taqman 5' Nuclease Real-time PCR for Quantitative Detection of Mycoplasma genitalium DNA in Males with and without Urethritis Who Were Attendees at a Sexually Transmitted Disease Clinic' van J.S. Jensen et al.a.[16] De sequentie van de primers en probes die voor deze PCR zijn gebruikt is terug te vinden in bBijlage I.
De PCR is specifiek voor de M.genitalium. De PCR is getest bij een aantal patiëntenmonsters, waarbij positieve urinemonsters, vaginale en anale uitstrijken en een positieve urethra uitstrijk zijn gevonden. De PCR wordt dus niet geremd als deze wordt uitgevoerd met DNA extractie uit patiëntenmonsters. Om de PCR te valideren zal de gevoeligheid nog moeten worden bepaald en zal er een remmingcontrole meegenomen moeten worden.

Summary

Yersinia enterocolitica is a Gram negative bacteria that infects the gastro-intestinal system. The Y.enterocolitica used to be detected in three days by a culture from faeces, using selective culture media. After identification, the bacteria needed to be characterized by the RIVM.,
what took even more time.
Detection of pathogenic Y.enterocolitica bacteria by a real-time PCR assay can save al lot of time. Beside that, there ha's already been developed a (multiplex-) PCR for several pathogenic bacteria in faeces and there is a possibility to insert the real-time PCR assay for detection of Y.enterocolitica to one of those PCR assay's, what will save even more time.
Therefore, the efficiency of this graduate report is to develop a PCR for several bacteria, including one to detect pathogenic serotypes of Yersinia enterocolitica and one for detection of Mycoplasma genitalium.

Through literature research it was already known that the Attachment Invasion Locus gene was only found in pathogenic Yersinia enterocolitica cultures and therefore a possible target for detection with PCR. After developing and testing several primers, it appeared that the primers from the article 'Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay' by W.J.B Wannet et ala.o. [12] was the best primerset.[12] After that, the probes were developed with the LightCycler® Probe Design program. The sequence of these primers and probes are shown in appendix I.
The PCR is validated on the new LightCycler® 480 II. [10] The PCR assay is found to be reliable and specific for pathogenic Y.enterocolitica. The assay detects <1 bacteria. This correlates with the results as described by W.J.B Wannet in his article. The decision to run this PCR together with the internal control and Shiga toxine-2f producing E.coli (STEC of Stx2f), made it necessary to make sure that the assay's didn't influence each other. The detection limit decreased to 4,5 bacteria per sample. A positive Stx2f decreased the Yersinia-PCR even more, which isn't a problem because both bacteria are rarely found in human samples. The chance a sample is positive for both is very small. After that, the dye's attached to the internal control and Y.enterocolitica probes were switched to increase the fluorescence of the Y.enterocolitica PCR.
After those experiments, the samples that were tested for microorganisms with the faeces screening PCR were tested again, but now together with the Y.enterocolitica-PCR to test if the results remained the same.

After developing and validating a real-time PCR for the detection of pathogenic types of Yersinia enterocolitica in faeces, a real-time PCR for the detection of Mycoplasma genitalium was developed and validated. This microorganism can cause urethritis in men and cervicitis en infertility in women. There was not yet an experiment to demonstrate this microorganism because it's very difficult to culture M.genitalium. Therefore, there has been started to develop a TaqMan® PCR for the detection of M.genitalium. The gene that codes for the MgPa-adhesion molecule, which the bacteria uses to attach to the epithelial cells in the fallopian tubes, is used as a target. This gene, called MgPb-gene, is part of the MgPa operon that exists out of three genes.
The primers en TaqMan® probe used for the Real Time PCR described in the article 'Use of a Taqman 5' Nuclease Real-time PCR for Quantitative Detection of Mycoplasma genitalium DNA in Males with and without Urethritis Who Were Attendees at a Sexually Transmitted Disease Clinic' by J.S. Jensen et ala.o.[16] was used to detect the MgpB-gen. The PCR is not yet validated completely. The sequence of these primers and probes are shown in appendix I.

The PCR is specific for M.genitalium. The PCR is performed with human samples to test for inhabitation. Urine samples, urethral and anal swabs were found positive. This shows the PCR is also positive with DNA extracted from human samples. To validate the PCR, the sensitivity needs to be tested and an internal control has to be constructed.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersAdmiraal de Ruyter laboratorium voor Medische Microbiologie & Immunologie; Goes
Datum2010-04
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk